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23 de Julio de 2020
CÓMO ELEGIR EL MEJOR DISPOSITIVO CENTRÍFUGO DE ULTRAFILTRACIÓN
Los dispositivos centrífugos de Pall simplifican muchos procedimientos comunes de preparación de muestras de ácido nucleico y proteínas. Estos dispositivos proporcionan concentración eficiente y eliminación de sal de muestras de 50 µL a 60 ml en solo minutos. Elija entre las membranas que se han desarrollado para asegurar una baja unión de biomoléculas no específicas y típicamente proporcionan una recuperación > 90% de biomoléculas objetivo.
Método de ultrafiltración
La ultrafiltración es una técnica de separación de membrana utilizada para separar partículas extremadamente pequeñas y moléculas disueltas en fluidos. La base principal para la separación es el tamaño molecular, aunque otros factores como la forma y la carga de la molécula también pueden desempeñar un papel. Las moléculas más grandes que los poros de la membrana se retendrán, pero no se unirán en la superficie de la membrana (no en la matriz polimérica, ya que se retienen en las membranas microporosas) y se concentrarán durante el proceso de ultrafiltración.
En comparación con los procesos que no son de membrana (cromatografía, diálisis, extracción con solvente o centrifugación), la ultrafiltración:
• Es más amable con las moléculas que se procesan.
• No requiere una extracción orgánica que pueda desnaturalizar las proteínas lábiles.
• Mantiene las condiciones iónicas y de pH.
• Es rápida y relativamente económico.
• Se puede realizar a bajas temperaturas (por ejemplo, en la cámara fría).
• Es muy eficiente y puede concentrar y purificar moléculas simultáneamente.
Las propiedades de retención de las membranas de ultrafiltración se expresan como Peso Molecular Nominal Límite (PMNL) (Molecular Weight Cut-off, MWCO) y se miden en Kilodaltons (kD). Este valor se refiere al peso molecular aproximado de un soluto globular diluido (es decir, una proteína típica) que la membrana retiene en un 90%. Sin embargo, la forma de una molécula puede tener un efecto directo sobre su retención por una membrana.
Por ejemplo, las moléculas lineales como el ADN pueden encontrar su camino a través de los poros que retendrán una especie globular del mismo peso molecular.
Existen tres aplicaciones genéricas para la ultrafiltración:
1. Concentración. La ultrafiltración es un método muy conveniente para la concentración de proteínas diluidas o muestras de ADN / ARN. Es gentil (no corta el ADN de hasta 100 Kb o causar pérdida de actividad enzimática en proteínas) y muy eficiente (típicamente> 90% de recuperación).
2. Desalinización e intercambio de buffers (diafiltración). La ultrafiltración proporciona una manera conveniente y eficiente para eliminar o intercambiar sales, eliminar detergentes, separar moléculas libres de moléculas unidas, eliminar componentes de bajo peso molecular o cambiar rápidamente el entorno iónico o de pH.
3. Fraccionamiento. La ultrafiltración no logrará una separación precisa de dos moléculas con pesos moleculares similares. Las moléculas a separar deben diferir en al menos un orden de magnitud (10X) en tamaño para una separación efectiva. El fraccionamiento mediante ultrafiltración es eficaz en aplicaciones, como la preparación de filtrados sin proteínas, la separación de etiquetas no unidas o no incorporadas de muestras de ADN y proteínas, y la purificación de productos de PCR a partir de reacciones de síntesis.
Selección de dispositivo según el volumen
Tabla 1. Selección de dispositivo por volumen
Dispositivo
Volumen de la muestra
< 0.5 mL
0.5 – 5.0 mL
5 – 20 mL
20 – 60 mL
Selección de membrana según la aplicación
Estas membranas cumplen los desafíos de una amplia gama de aplicaciones con un rendimiento y estabilidad superior:
• Membrana de ultrafiltración Omega (polietersulfona modificada) para una rápida concentración y desalación.
• Membranas de microfiltración Bio-Inert (nylon modificado), Supor (polietersulfona) y wwPTFE, para eliminar partículas (como restos de gel).
• Fibra de vidrio para la unión de ácidos nucleicos.
Eligiendo el Peso Molecular Nominal Límite (PMNL) (Molecular Weight Cut-off, MWCO) correcto
Una vez que se determina el volumen de la muestra, el siguiente paso es seleccionar el Peso Molecular Nominal Límite (PMNL) (MWCO) apropiado (para ultrafiltración) o el tamaño de poro (para microfiltración). Las MWCO son clasificaciones nominales basadas en la capacidad de retener > 90% de un soluto de un peso molecular conocido (en kilodaltons). La Tabla 2 proporciona características de retención de membranas de diferentes Pesos Molecular Nominal Límite (PMNL) (MWCO) para algunos solutos. Para las proteínas, se recomienda seleccionar un (PMNL) (MWCO) que sea de tres a seis veces más pequeño que el peso molecular del soluto retenido. Si la velocidad de flujo es una consideración, elija una membrana con un (PMNL) (MWCO) en el extremo inferior de este rango (3X). Si la principal preocupación es la retención, elija una membrana más ajustada (6X).
Es importante reconocer que la retención de una molécula por una membrana de ultrafiltración está determinada por una variedad de factores, entre los cuales su peso molecular sirve solo como un indicador general.
Por lo tanto, elegir el (PMNL) (MWCO) apropiado para una aplicación específica requiere la consideración de una serie de factores que incluyen la forma molecular, la carga eléctrica, la concentración de la muestra, la composición de la muestra y las condiciones de funcionamiento.
Debido a que diferentes fabricantes usan diferentes moléculas para definir el (PMNL) (MWCO) de sus membranas, es importante realizar experimentos piloto para verificar el rendimiento de la membrana en una aplicación particular.
Variables comunes que aumentan el paso de moléculas:
• Concentración de muestra inferior a 1 mg / ml.
• Moléculas lineales versus moléculas globulares.
• Alta presión transmembrana creada por la fuerza g en concentradores centrífugos. (Esto es especialmente importante en el caso de las moléculas lineales, por ejemplo, fragmentos de ADN. La disminución de la fuerza g puede aumentar la retención de moléculas por una membrana).
• Composición del buffer que favorece la ruptura de las moléculas.
• El pH y las condiciones iónicas que cambian la molécula (por ejemplo, causan cambios conformacionales).
Variables comunes que disminuyen el paso de moléculas:
• Concentración de muestra superior a 1 mg / ml.
• Condiciones de amortiguación que permiten que las moléculas se agreguen.
• Presencia de otras moléculas que aumentan la concentración de la muestra.
• Baja presión transmembrana (en el caso de concentradores centrífugos, menor fuerza g).
• Adsorción a la membrana o dispositivo.
• Baja temperatura (4 ° C vs. 24 ° C).
Tabla 2: Selección de Peso Molecular Nominal Límite (PMNL) (MWCO) para aplicaciones de proteína
* Tamaño nominal de poro medido por microscopía electrónica
** No disponible en Nanosep
*** No disponible en Microsep o Macrosep Avanzado
Selección de Peso Molecular Nominal Límite (PMNL) (MWCO) para aplicaciones de ácido nucleico
* No disponible en Nanosep
** No disponible en Microsep o Macrosep Avanzado
Selección de Peso Molecular Nominal Límite (PMNL) (MWCO) para aplicaciones de virus
* Tamaño nominal de poro medido por microscopía electrónica.
Codificación de color
Los dispositivos centrífugos de Pall Laboratory están disponibles en una gama de Peso Molecular Nominal Límite (PMNL) (MWCO) codificados por colores para una fácil identificación.
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