DR6000 para la determinación cuantitativa y cualitativa de ADN y ARN

Análisis fotométricos para la medición cuantitativa y cualitativa de ADN y ARN

La purificación de muestras de ADN/ARN en laboratorios de biología molecular, con kits que normalmente se compran, requiere en última instancia una comprobación de la pureza del ADN/ARN que contienen, ya que no se puede descartar la contaminación con proteínas o componentes orgánicos.

Un método conveniente para determinar la pureza del ADN/ARN es la medición fotométrica, ya que se puede realizar más rápidamente que opciones como la electroforesis en gel. Además de determinar la pureza del ADN/ARN, el DR6000 también ofrece métodos sencillos para cuantificar muestras de ADN/ARN mediante fotometría UV.

Las siguientes medidas se pueden tomar con el DR6000:

Métodos

– Determinación de la concentración de ssDNA/dsDNA y RNA (medida a 260 nm)

– Determinación de la pureza de DNA/RNA – contaminación con proteínas (relación 260/280)

– Determinación de la pureza de DNA/RNA – contaminación con proteínas y componentes orgánicos como fenolatos o isocianatos (relación 230/260/280)

Determinación de la concentración de ssDNA, dsDNA y RNA

La determinación de la concentración de ADN o ARN se basa en la absorción de las muestras a 260 nm. Los anillos aromáticos de las bases en el ADN/ARN son los responsables de la absorción. En elDR6000, la concentración se determina en una cubeta de cuarzo de 1 cm. El DR6000 se pone a cero a una longitud de onda de 260 nm usando una cubeta que contiene solo la solución en la que está presente el ADN/ARN (generalmente el tampón TRIS).

A continuación, se mide la solución de ADN/ARN y se determina la concentración sobre la base de la extinción medida a 260 nm. La literatura describe los siguientes factores de conversión que se pueden usar para calcular la concentración de ssDNA, dsDNA o RNA usando una cubeta de 1-cm sobre la base de la absorción a 260 nm (A260nm):

Estos factores de conversión se derivan de los coeficientes de absorción espectral de ssDNA, dsDNA o RNA y laconversión de la ley de Beer-Lambert .

A260nm(cubeta de 1-cm) = 1.000, corresponde a 50 μg/mL dsADN

40 μg/mL ssADN

33 μg/ml de ARN

Tres ejemplos de medidas de concentración en elprograma de usuario ADN/ARN conc. utilizando muestras de ADN/ARN purificado con contenidos crecientes se exponen a continuación. Los resultados se emiten como µg/L dsDNA, ssDNA y RNA y se pueden adaptar a los requisitos.

Investigación de la pureza de la muestra de ADN/ARN:

Las soluciones de ADN/ARN obtenidas tras la purificación en el laboratorio están contaminadas principalmente con proteínas u otros componentes orgánicos. Como las proteínas se absorben a 280 nm debido a los residuos de aminoácidos aromáticos, la contaminación de la muestra de ADN/ARN con proteínas se puede determinar midiendo a 260 nm y también a 280 nm.

– Una muestra de ADN puro tiene una proporción de absorción 260/absorción 280 de 1,8 o superior

– Una muestra de ARN puro tiene una proporción de absorción 260/absorción 280 de 2,0 o superior

Puede haber contaminación adicional de la muestra de ADN/ARN con sustancias orgánicas como fenolatos o isocianatos. Se toma una medida adicional a 230 nm para medir esta contaminación.

– Una muestra de ADN puro tiene una proporción de absorción 230/absorción 260/absorción 280 de 1/1,8/1

– Una muestra de ARN puro tiene una proporción de absorción 230/absorción 260/absorción 280 de 1/2/1

En el DR6000, la pureza de la muestra de ADN/ARN se puede medir midiendo simultáneamente la absorción a 260 nm y 280 nm (230 nm) en una cubeta de cuarzo de 1 cm. Las siguientes figuras muestran los resultados en el DR6000 luego de la medición de una muestra de ADN casi pura y una contaminada con proteínas (albúmina de suero bovino; BSA).

El grado de pureza de la muestra desciende de 1,73 a 1,50 como consecuencia de la contaminación con BSA. La absorción ligeramente elevada a 260 nm (de 1,52 de absorción a 1,71 de absorción) simula un mayor contenido de ADN.

Escaneo de longitud de onda

La función de exploración de longitud de onda del DR6000 también se puede utilizar para determinar la pureza de una muestra de ADN/ARN y para determinar la posible contaminación con proteínas. La siguiente captura de pantalla muestra exploraciones de longitud de onda que comparan una muestra de ADN de 60 µg/L (naranja) y una muestra de BSA (albúmina sérica bovina) de 2000 µg/L (azul).

Mientras que la muestra de ADN muestra la absorción máxima a 260 nm y la absorción a 260 nm también es significativamente mayor que a 280 nm, la curva de absorción para la solución de proteína (aquí: 2000 µg/L BSA) muestra la absorción máxima a 280 nm.

Esta diferencia en los comportamientos de absorción de las soluciones de ADN y proteína se puede utilizar para comprobar la pureza de la muestra de ADN con un escaneo. La siguiente figura muestra el escaneo de una muestra de ADN (60 µg/L) contaminada con una solución de proteína (2000 µg/L) en comparación con una muestra de ADN casi pura. Está claro que la absorción a 280 nm aumenta desproporcionadamente como resultado de la solución de proteína. El cociente absorción 260 nm/absorción 280 nm para determinar la pureza de la muestra de ADN se reduce de 1,76 a 1,19.

Resumen

Sus funciones y opciones para medir en el rango UV y la función de escaneo de longitud de onda con una comparación con una referencia hacen del DR6000 una herramienta importante en el análisis de muestras de ADN y ARN. Tanto la cuantificación de muestras de ADN y ARN como la determinación de la pureza de las muestras se pueden realizar de forma rápida y sencilla mediante espectroscopia UV. Esto permite que los métodos del DR6000 se adapten a las tareas del laboratorio de la manera más efectiva posible con programas de usuario libremente programables.