Soluciones Avanzadas para la Preparación y Detección de Muestras Proteicas

A medida que las muestras se hacen más pequeñas y más numerosas, la necesidad de métodos novedosos para purificar proteínas y mejorar los ensayos ha llevado a Pall a desarrollar una amplia línea de placas de filtrado de pocillos múltiples que se dirigen a retos de aplicación específicos. Las placas filtrantes AcroPrep Advance están diseñadas para proporcionar un rendimiento superior en una multitud de aplicaciones de preparación y cribado de muestras. Estas placas filtrantes han sido optimizadas para cumplir con los estrictos requisitos de las aplicaciones de alto rendimiento. Su mecanismo de sellado sella individualmente cada pocillo para evitar la contaminación cruzada de las muestras, al igual que el conductor de fluidos avanzado en el fondo de la placa.

Los dispositivos centrífugos simplifican muchos procedimientos de manipulación de proteínas. Estos proporcionan una eficiente concentración y eliminación de sales de muestras de 50 μL a 60 mL en tan solo unos minutos. Elija entre las membranas que han sido desarrolladas para asegurar una baja unión inespecífica de biomoléculas y proporcionar una alta y consistente recuperación de las moléculas objetivo. La ultrafiltración reduce la cantidad de manipulación que puede causar daños a las muestras, dejando las muestras concentradas listas para su incorporación directa a las aplicaciones posteriores en etapas críticas del proceso de investigación.

CROMATOGRAFÍA

La purificación de proteínas a partir de una muestra compleja, como un cultivo celular o suero, requiere más de un paso cromatográfico. Normalmente, el primer paso es el intercambio iónico (IEX) o la cromatografía de modo mixto para fraccionar la muestra y obtener una subpoblación de proteínas que contengan la molécula objetivo. A esto le siguen pasos posteriores para fraccionar aún más la subpoblación hasta alcanzar el nivel de pureza deseado. Cada paso del proceso de purificación requiere una optimización para maximizar el rendimiento y la pureza de la proteína objetivo. Por lo tanto, los experimentos de purificación a pequeña escala se utilizan durante la fase de desarrollo y optimización para preservar la muestra mientras se proporciona información crucial. Los métodos demuestran el uso de las placas filtrantes de 96 pocillos AcroPrep™ Advance combinadas con medios de cromatografía como una herramienta eficiente para el fraccionamiento de muestras de proteínas de pequeño volumen.

WESTERN BLOTTING

El western blot es una técnica analítica en biología molecular que se utiliza para investigar y caracterizar las modificaciones postraduccionales de una proteína, su identificación y en la validación de su producción. La clave para obtener resultados fiables y reproducibles es una imagen limpia y con poco fondo. Los problemas pueden surgir con membranas de baja resistencia a la tracción, una señal de fondo elevada, un elevado desgaste de la membrana, compatibilidad limitada con los métodos de detección, etc. Las membranas de alta calidad son imprescindibles para evaluar la abundancia relativa de las proteínas con fines analíticos. Las membranas de blotting de Pall ofrecen propiedades de alta resistencia a la tracción con bajos niveles de fondo.

¿Cuál es su método de detección de Western Blot de elección?

Aunque los pasos de los protocolos de western blot siguen siendo los mismos, los métodos de detección varían.

• El primer paso es la separación de las proteínas mediante electroforesis en gel de una muestra que contiene una mezcla de proteínas. Los dispositivos centrífugos Nanosep® de Pall con membranas Omega™ de baja unión a proteínas son ideales para concentrar las muestras para la electroforesis en gel.

• Una vez separadas en el gel, las proteínas se transfieren a una membrana de fluoruro de polivinilideno (PVDF) o a una membrana de nitrocelulosa. Este paso inmoviliza las proteínas para su posterior análisis.

• A continuación, la membrana se incuba con anticuerpos marcados específicos para la proteína de interés.

• Después de la incubación, la membrana se lava para eliminar los anticuerpos no unidos y se sigue analizando mediante diversas técnicas de inmunodetección.

Pall ofrece una variedad de membranas de transferencia que han sido optimizadas para aplicaciones de western blotting. Su naturaleza sensible produce resultados de alta resolución con bajo fondo y burn-through. Elija entre una gama de formatos de uso común, como rollos, discos, hojas o cortes personalizados.

• FluoroTrans® PVDF: optimizada para la detección fluorescente para garantizar un fondo muy bajo que no interferirá con la detección y el análisis de proteínas.

• FluoroTrans W PVDF: óptima para su uso con métodos tradicionales de tinción y detección quimioluminiscente, por su alta sensibilidad, bajo burn-through y bajo fondo.

• BioTrace™ NT: medio puro de nitrocelulosa sin soporte que es compatible con una variedad de sistemas de detección y con una alta capacidad de unión para ácidos nucleicos y proteínas, lo que está garantizado gracias a la naturaleza homogénea de la membrana. Otras membranas de nitrocelulosa contienen altos niveles de acetato de celulosa que reducen la capacidad de unión de proteínas de la membrana. Sus características físicas como la alta resistencia a la tracción y la hidrofilia, le dan una excelente manipulación, asegurando que la membrana no se rasgue, rompa o agriete durante las transferencias. Dado que no contiene detergentes y no tiene soporte, produce imágenes más nítidas con poca o ninguna distorsión y tiene un menor desgaste de proteínas que los medios de nitrocelulosa de la competencia en las transferencias electroforéticas. Altamente consistente, tanto entre lotes como dentro de ellos, esta membrana proporciona una detección sensible de biomoléculas blot tras blot.

CONCENTRACIÓN DE PROTEÍNAS E INTERCAMBIO DE TAMPONES

La purificación de biomoléculas implica una compleja serie de pasos en los que los objetivos se separan selectivamente a través de procesos secuenciales. El proceso por el que se realiza la separación a menudo crea la necesidad de desalar o concentrar la muestra para prepararla para el siguiente paso del proceso de purificación. Pall ofrece varias tecnologías para llevar a cabo una eficiente concentración de la muestra, desalación e intercambio de tampones, incluyendo filtros de giro de ultrafiltración (UF) yplacas de filtración multipozo UF.

La ultrafiltración consiste en forzar una solución proteica a través de una membrana con un peso molecular definido. La proteína no atraviesa la membrana, mientras que los demás componentes del tampón sí lo hacen. Este método suele ser rápido y no afecta negativamente a la muestra de proteínas. La ultrafiltración se realiza por centrifugación. La muestra de proteínas se coloca en el cartucho y se hace girar hasta que la solución de proteínas, que queda por encima del filtro, alcanza el volumen deseado. El filtrado también se puede recuperar y evaluar.

Otra de las aplicaciones habituales de estos dispositivos es el intercambio de tampones o la desalación. Hay algunas aplicaciones posteriores muy sensibles a la sal, como la electroforesis en gel, la RMN, la cristalografía de rayos X y la espectrometría de masas. Es necesario eliminar la sal antes de llevar a cabo estas aplicaciones. Una forma sencilla de conseguirlo es utilizar un dispositivo centrífugo, como los dispositivos centrífugos Nanosep® y Nanosep MF.

FRACCIONAMIENTO DE PROTEÍNAS

El fraccionamiento mediante ultrafiltración de soluciones complejas de proteínas y la separación de etiquetas no unidas o no incorporadas de muestras de proteínas son algunas de las principales aplicaciones de estos dispositivos centrífugos. Es importante señalar, que este método también es válido para eliminar los restos celulares después de la lisis celular para purificar parcialmente el producto proteico que se encuentra en el filtrado. Esto es importante porque si las dos proteínas que hay que fraccionar estuvieran próximas en tamaño, entonces sería imposible purificarlas entre sí. En ese caso habría que utilizar métodos cromatográficos más costosos, western blotting o ELISA.

Fuentes

Pall Life Sciences. Protein Sample Preparation & Detection. USA.