Dispositivos centrífugos: Simplificando la preparación de muestras de proteínas y ácidos nucleicos

Los dispositivos centrífugos  de Pall simplifican muchos procedimientos rutinarios de preparación de muestras de proteínas y ácidos nucleicos. Estos dispositivos proporcionan una concentración eficiente y eliminación de sal de muestras desde 50 μl hasta 60 ml en solo minutos.

La ultrafiltración (UF) es una técnica de separación por membranas basada en el tamaño molecular, aunque otros factores, como la forma y la carga de la molécula, también pueden influir. Las moléculas más grandes que los poros de la membrana de UF se retendrán en la superficie de esta, mientras que el disolvente y las moléculas de soluto más pequeñas pueden pasar libremente a través. Esta exclusión molecular en la superficie de la membrana de UF conduce a la concentración del soluto proteico en la fracción retenida (el retenido) y puede recuperarse por encima de la membrana.

Hay tres aplicaciones genéricas para la ultrafiltración:

1. Concentración. La ultrafiltración es un método muy conveniente para la concentración de proteínas diluidas o muestras de ADN/ARN. Es suave y no corta el ADN hasta 100 Kb ni causa pérdida de actividad enzimática en las proteínas. También es muy eficiente, por lo general ofrece una recuperación> 90%.

2. Desalación e intercambio de tampones (diafiltración). La ultrafiltración proporciona una forma conveniente y eficiente para eliminar o intercambiar sales, eliminar detergentes, separar moléculas libres de moléculas unidas, eliminar componentes de bajo peso molecular o cambiar rápidamente el entorno iónico o de pH.

3. Fraccionamiento. El fraccionamiento mediante ultrafiltración es eficaz en aplicaciones como la preparación de filtrados sin proteínas, la separación de muestras de ADN y proteínas de marcaje no unido o no incorporado y la purificación de productos de PCR a partir de reacciones de síntesis.

Los dispositivos centrífugos pueden reemplazar las técnicas de separación tradicionales, como la cromatografía en columna, la electroforesis preparativa, la precipitación con alcohol o sal, la diálisis y la centrifugación en gradiente cuando se realiza lo siguiente:

• Concentración de proteínas o ácidos nucleicos

• Desalación

• Intercambio de búfer

• Fraccionamiento de mezclas de proteínas

• Separación de cebadores de productos de PCR

• Separación de ácidos nucleicos o proteínas marcados de nucleótidos no incorporados

• Concentración o eliminación de virus

• Clarificación de lisados celulares y homogeneizados de tejidos

Recuperación de ADN como función del dispositivo MWCO

Se centrifugó una muestra de 500 μl de una solución de fragmento de ADN de 100 μg/ml que contenía fragmentos de ADN bicatenario de 50 y 500 bp a 5.000 x g en dispositivos Nanosep hasta un volumen final de 50 μl.

Las muestras recuperadas se cuantificaron usando absorbancia a 260 nm.

El dispositivo de 100K  pudo diferenciar entre los tamaños de los fragmentos de ADN.

Dispositivos centrífugos Macrosep Advance: tiempo de centrifugado reducido

Las soluciones de proteínas se procesaron en cada uno de los dispositivos Macrosep Advance.

El tiempo promedio (minutos) se representa frente a ml de producto restante a filtrar usando un rotor de cubeta oscilante a 5,000 x g. Las soluciones son 3K: Sulfato de Protamina, 0,1% en 1X PBS; 10K: Citocromo C, 0,025% en 1X PBS; 30K : IgG, 0,1% en 1x PBS; y 100K: apoferritina, 0,1% en 1X PBS