Soluciones para Eficiente Purificación de ADN y ARN

La llegada de las técnicas de secuenciación de nueva generación ha permitido recopilar cantidades de datos sin precedentes en cortos periodos de tiempo. Esto ha contribuido en gran medida a nuestra comprensión de la estructura genómica y de los genes en muchas especies, además de obtener mucha información sobre los genes candidatos para los trastornos genéticos, las mutaciones somáticas causantes de cáncer y la mala expresión debida a cambios epigenéticos. La validación de los genes candidatos puede llevarse a cabo mediante modelos de enfermedad creados por ingeniería genética en cultivos de células de mamíferos o en modelos de animales completos.

La mayor parte de los flujos de trabajo implicados en estos estudios se llevan a cabo con un alto rendimiento, con la ayuda del uso de placas de filtro de unión de ADN de varios pocillos que permiten obtener un mayor número de muestras de ADN genómico en paralelo.

PURIFICACIÓN DEL RNA TOTAL

En muchos estudios de análisis de expresión génica de alto rendimiento, las células de mamífero cultivadas se exponen a diferentes reactivos o condiciones de crecimiento, y se utilizan enfoques de PCR cuantitativa de transcripción inversa (RT-qPCR) para medir la influencia de las diversas condiciones en la expresión de los genes de interés. Estos tipos de estudios se ven muy favorecidos por la disponibilidad de placas filtrantes de varios pocillos con medios basados en sílice que permiten el aislamiento de ARN total de alto rendimiento a partir de células de mamífero cultivadas de forma robusta.

La placa de filtro de punta larga de 96 pocillos AcroPrep Advance de Pall para la unión de ácidos nucleicos incorpora un medio de fibra de vidrio de cuarzo con base de sílice para permitir la unión eficiente de ADN y ARN, a la vez que proporciona un flujo suave y un procesamiento rápido de las muestras. Este medio ofrece a los investigadores la flexibilidad de purificar el ADN plasmídico de las bacterias y el ADN genómico o el ARN total de las muestras de cultivo celular: una sola placa para múltiples aplicaciones. Reducir la posibilidad de contaminación cruzada es fundamental para obtener resultados de calidad reproducibles. La nueva placa de punta larga de Pall minimiza la formación de gotas colgantes, reduciendo así la posibilidad de contaminación cruzada. Es una placa multiuso que proporciona flexibilidad en las aplicaciones, reduce el riesgo de contaminación cruzada y permite un flujo suave para el procesamiento de las muestras.

PURIFICACIÓN DEL ADN GENÓMICO

Las placas filtrantesAcroPrep Advance MWCO de 96 pocillos pueden utilizarse para concentrar el ácido nucleico de interés si se agrupan múltiples fracciones antes de realizar el análisis posterior. Normalmente, las aplicaciones posteriores pueden incluir la PCR y la necesidad de purificar los cebadores no incorporados y los dNTPS del producto de la PCR. Es así que Pall suministra una gama de placas filtrantes de 96 pocillos AcroPrep Advance MWCO y productos de centrifugación que pueden ayudar en estas aplicaciones.

NORTHERN & SOUTHERN BLOTTING

Los Northern y Southern blot son técnicas estándar de biología molecular para la identificación y cuantificación del ARN y el ADN, respectivamente. El aislamiento y la detección eficaces de ARN y ADN en la investigación de biología molecular son fundamentales para el descubrimiento de genes, la secuenciación y el mapeo utilizados en el diagnóstico y las aplicaciones industriales. La claridad de los resultados visuales es crucial para el proceso de blotting: ambos métodos de análisis se basan en la inmovilización del ácido nucleico. El ARN y los fragmentos se separan por tamaño en una membrana para permitir el uso de sondas macromoleculares para su identificación, detección y visualización.

Para obtener resultados inequívocos, y evitar repeticiones y retrasos, la membrana de transferencia debe tener el nivel adecuado de sensibilidad, bajo ruido de fondo y consistencia de la superficie. Cuando las moléculas de ARN y ADN son menos abundantes, pueden ser difíciles de aislar y visualizar. La membrana y el protocolo de detección deben proporcionar la sensibilidad necesaria para detectar un bajo número de moléculas de interés sin captar interferencias de fondo. Para cuantificar correctamente los patrones de expresión de ARN y la presencia global de ADN se requiere una imagen clara con un bajo fondo.

• Biodyne A: Anfotérica, lo que significa que el potencial zeta de la membrana puede ser modulado por cambios en el pH. Ideal para sondas individuales o rehibridación múltiple, y aplicaciones en las que el fondo es problemático.

• Biodyne B: Membrana con carga positiva. La membrana de nylon de mayor sensibilidad para aplicaciones de ácidos nucleicos.

• Biodyne Plus: Cargada positivamente con un punto isoeléctrico extremadamente alto, lo que significa que mantendrá bien su carga con los cambios de pH. Adecuada para la detección quimifluorescente. Con ciertos sistemas de detección no radiactivos, es más sensible que la membrana Biodyne A y presenta un fondo menor que la membrana Biodyne B.

• Biodyne C: Ideal para aplicaciones especializadas, ya que puede derivarse mediante reacciones de acoplamiento a través de los grupos carboxílicos de la superficie de los poros.

PURIFICACIÓN DE PLÁSMIDOS DE ADN Y ARN

El ADN plasmídico desempeña un papel fundamental en la investigación de la biología molecular, pero su obtención a partir de cultivos procariotas puede resultar complicada. Es necesario separarlo del ADN genómico en un complejo procedimiento de lisis y purificación. Pall Life Sciences suministra productos que permiten obtener ADN plasmídico a partir de cultivos procariotas de forma que se conservan mayores cantidades que las que pueden encontrarse en las muestras preenvasadas y a un coste menor. El ADN plasmídico se utiliza para expresar proteínas recombinantes en diversos organismos huéspedes durante la investigación en biología molecular y proteínas. Los avances en la tecnología de clonación han llevado a la necesidad de contar con numerosas muestras de pequeños cultivos de ADN plasmídico. La preparación a pequeña escala de ADN plasmídico requiere purificaciones paralelas mediante una manipulación semiautomatizada o totalmente automatizada.

El lisado es el primer paso para purificar los plásmidos del interior de las células cultivadas. Una vez que el ADN ha sido extraído con éxito, debe ser clarificado para eliminar los restos celulares. Muchos fabricantes han creado kits para preparar muestras grandes y pequeñas de ADN plasmídico para su uso en investigación. Estos kits son caros e ineficaces. Incluyen tubos de centrifugado individuales además de formatos de placas de 96 pocillos. Cuando se utiliza un tubo de centrifugación simple para la purificación de plásmidos, generalmente se utiliza la centrifugación para aclarar el ADN, lo que da lugar a varias complicaciones. Los tiempos de centrifugación son largos, la capacidad del rotor es insuficiente para el procesamiento en un solo tubo y los pellets esponjosos que se utilizan durante el proceso pueden atrapar una cantidad significativa de ADN plasmídico debido a la sedimentación.

Fuentes

Pall Life Sciences. DNA & RNA Purification: Proven and trusted products for DNA and RNA purification. Discover the essential partnership for all your research needs. USA.